一、方案詳情
1.1 方案目標(biāo)
1. 基于北京六一電腦三恒多用電泳儀電源DYY-6D（以下簡(jiǎn)稱DYY-6D）的恒壓、恒流、恒功率“三恒”特性，建立針對(duì)基因組DNA、質(zhì)粒DNA及常規(guī)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)化電泳分離流程，明確不同樣本類型下的最優(yōu)電源參數(shù)設(shè)置、凝膠制備及電泳操作關(guān)鍵技術(shù)要求；2. 系統(tǒng)分析電壓（50-200V）、電流（10-100mA）、電泳時(shí)間（20-90min）對(duì)核酸片段分辨率、蛋白條帶清晰度及遷移速率的影響規(guī)律，確定復(fù)雜樣本（如組織基因組DNA、細(xì)胞總蛋白）的適配電泳條件；3. 以標(biāo)準(zhǔn)核酸Marker（DL2000、λ-Hind III）和蛋白Marker（10-180kDa）為參照，驗(yàn)證DYY-6D在不同分離場(chǎng)景下的穩(wěn)定性、重復(fù)性及分離準(zhǔn)確性；4. 對(duì)比DYY-6D與普通電泳儀電源的性能差異，解決傳統(tǒng)設(shè)備電壓波動(dòng)導(dǎo)致的條帶彌散、分離效率低等問題，為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供高效可靠的電泳分離技術(shù)支撐。
1.2 實(shí)驗(yàn)原理
DYY-6D作為電腦三恒多用電泳儀電源，核心功能是為電泳系統(tǒng)提供穩(wěn)定可控的電場(chǎng)環(huán)境，其“三恒”控制模式可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求精準(zhǔn)維持電泳過程中的電壓、電流或功率恒定。在電場(chǎng)作用下，核酸（帶負(fù)電）與蛋白（經(jīng)SDS處理后帶負(fù)電）會(huì)沿電場(chǎng)方向向正極遷移，遷移速率取決于分子大小、電荷密度及凝膠孔徑。
DYY-6D的技術(shù)優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在三方面：一是輸出精度高，恒壓模式下電壓波動(dòng)≤±0.5%，恒流模式電流波動(dòng)≤±1%，可避免電場(chǎng)不穩(wěn)定導(dǎo)致的條帶偏移；二是適配性廣，支持1-4組電泳槽同時(shí)工作，兼容瓊脂糖凝膠電泳（核酸）與聚丙烯酰胺凝膠電泳（蛋白）；三是智能保護(hù)完善，具備過流、過壓、過載及漏電保護(hù)功能，且實(shí)時(shí)顯示電泳參數(shù)，便于實(shí)驗(yàn)過程監(jiān)控。
1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑
1.3.1 儀器設(shè)備
- 核心設(shè)備：北京六一電腦三恒多用電泳儀電源DYY-6D（輸出范圍：電壓10-300V，電流4-100mA，功率1-300W，具備恒壓/恒流/恒功率切換功能，支持定時(shí)設(shè)置0-999min）；
- 聯(lián)用設(shè)備：北京六一水平電泳槽DYCP-31BN（用于核酸電泳，凝膠面積120×100mm）、垂直電泳槽DYCZ-24DN（用于蛋白電泳，凝膠尺寸83×73mm）；
- 輔助設(shè)備：紫外凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad ChemiDoc XRS+）、高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf 5418R）、移液器（10μL/100μL/1000μL，Thermo）、電子天平（梅特勒ME204E，精度0.1mg）、恒溫水浴鍋（上海一恒HH-S4）；
- 樣品處理設(shè)備：超聲波細(xì)胞破碎儀（寧波新芝JY92-IIN）、核酸提取儀（天根DP304）。
1.3.2 試劑與材料
- 核酸實(shí)驗(yàn)試劑：瓊脂糖（西班牙Biowest）、TAE電泳緩沖液（50×濃縮液，Solarbio）、核酸Marker（DL2000：100-2000bp；λ-Hind III：500-23130bp，Takara）、GoldView核酸染料（Solarbio）、質(zhì)粒DNA（pET-28a，實(shí)驗(yàn)室保存）、小鼠肝臟基因組DNA（自行提取）；
- 蛋白實(shí)驗(yàn)試劑：丙烯酰胺（Acr）、甲叉雙丙烯酰胺（Bis）、SDS（十二烷基硫酸鈉）、Tris堿、甘氨酸、β-巰基乙醇、考馬斯亮藍(lán)R-250（均為Amresco）、蛋白Marker（10-180kDa，Thermo）、牛血清白蛋白（BSA，Sigma）、HeLa細(xì)胞總蛋白（自行提?。?；
- 其他材料：電泳級(jí)甲醇、冰乙酸（國(guó)藥集團(tuán)）、一次性手套、移液器吸頭、離心管（1.5mL/50mL）、硝酸纖維素膜（GE）。
1.4 實(shí)驗(yàn)方法
1.4.1 樣品制備
- 核酸樣品：①質(zhì)粒DNA：通過堿裂解法提取后，用超純水稀釋至50ng/μL，-20℃保存；②基因組DNA：采用酚-氯仿法從小鼠肝臟組織中提取，經(jīng)Nanodrop檢測(cè)純度（A260/A280=1.82），濃度調(diào)整為100ng/μL；③標(biāo)準(zhǔn)核酸Marker：DL2000用1×TAE緩沖液稀釋至10ng/μL，λ-Hind III稀釋至20ng/μL。
- 蛋白樣品：①BSA標(biāo)準(zhǔn)品：用蛋白上樣緩沖液配制濃度為0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL的梯度樣品；②HeLa細(xì)胞總蛋白：通過RIPA裂解液提取，BCA法測(cè)定蛋白濃度為1.2mg/mL，加入上樣緩沖液后95℃變性5min，-80℃保存；③蛋白Marker：直接加入上樣緩沖液，無需稀釋。
1.4.2 凝膠制備
- 核酸電泳凝膠：根據(jù)分離需求制備不同濃度瓊脂糖凝膠，①小片段核酸（100-2000bp）：1.5%瓊脂糖凝膠，加入GoldView染料（終濃度1×）；②大片段基因組DNA（500-23130bp）：0.8%瓊脂糖凝膠，染料添加同前，凝膠凝固后備用。
- 蛋白電泳凝膠：制備SDS-PAGE凝膠，①分離膠（12%）：Acr/Bis（30%）4mL、Tris-HCl（1.5M，pH8.8）2.5mL、10%SDS 0.1mL、10%過硫酸銨0.1mL、TEMED 0.004mL，加超純水補(bǔ)至10mL；②濃縮膠（5%）：Acr/Bis（30%）0.67mL、Tris-HCl（0.5M，pH6.8）1.25mL、10%SDS 0.05mL、10%過硫酸銨0.05mL、TEMED 0.005mL，加超純水補(bǔ)至5mL。
1.4.3 電泳參數(shù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
以條帶分辨率（核酸片段分離清晰度、蛋白條帶規(guī)整度）和遷移效率（單位時(shí)間內(nèi)遷移距離）為核心評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)（L9(3?)），優(yōu)化DYY-6D的工作參數(shù)，因素及水平設(shè)置如下：
- 核酸電泳（以1.5%瓊脂糖凝膠分離DL2000為例）：A因素（電壓）：A1（80V）、A2（120V）、A3（160V）；B因素（電流）：B1（30mA）、B2（50mA）、B3（70mA）；C因素（電泳時(shí)間）：C1（30min）、C2（45min）、C3（60min）。
- 蛋白電泳（以12%SDS-PAGE分離HeLa蛋白為例）：A因素（電壓-濃縮膠）：A1（60V）、A2（80V）、A3（100V）；B因素（電壓-分離膠）：B1（100V）、B2（120V）、B3（150V）；C因素（電泳時(shí)間）：C1（60min）、C2（80min）、C3（100min）。
每種實(shí)驗(yàn)組合重復(fù)3次，通過凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度值與遷移距離，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），確定最優(yōu)參數(shù)組合。
1.4.4 電泳操作流程
- 儀器連接：將DYY-6D電源與對(duì)應(yīng)電泳槽連接，確保正負(fù)極對(duì)應(yīng)正確（核酸/蛋白電泳均為樣品孔靠近負(fù)極），開啟電源，進(jìn)入?yún)?shù)設(shè)置界面。
- 參數(shù)設(shè)置：根據(jù)樣品類型選擇“恒壓”模式（優(yōu)先推薦，確保分離穩(wěn)定），輸入優(yōu)化后的電壓、電流上限及電泳時(shí)間參數(shù)，啟動(dòng)電泳。
- 樣品上樣與檢測(cè)：①核酸電泳：每孔上樣量10μL（含樣品5μL+上樣緩沖液5μL），電泳結(jié)束后置于紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照；②蛋白電泳：每孔上樣量20μL，電泳結(jié)束后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色2h，脫色液脫色至條帶清晰，再進(jìn)行成像分析。
- 性能驗(yàn)證：在最優(yōu)參數(shù)下，對(duì)同一樣品進(jìn)行6次平行電泳驗(yàn)證重復(fù)性；連續(xù)5天進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)Marker電泳，驗(yàn)證電源長(zhǎng)期穩(wěn)定性；通過條帶遷移距離與Marker對(duì)比，計(jì)算核酸片段大小及蛋白分子量。
1.4.5 評(píng)價(jià)指標(biāo)計(jì)算方法
- 分辨率（R）：核酸電泳中R=2×(d2-d1)/(W1+W2)，其中d為條帶中心到上樣孔的距離，W為條帶寬度；蛋白電泳中R計(jì)算方法相同，反映條帶分離清晰度。
- 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）：用于評(píng)價(jià)重復(fù)性，RSD=（標(biāo)準(zhǔn)偏差/測(cè)量值平均值）×100%，測(cè)量值包括條帶遷移距離、灰度值。
- 遷移速率（V）：V=遷移距離/電泳時(shí)間，單位為mm/min，反映分離效率。
- 分子量偏差率（RE）：蛋白實(shí)驗(yàn)中，RE=|計(jì)算分子量-標(biāo)準(zhǔn)分子量|/標(biāo)準(zhǔn)分子量×100%，評(píng)價(jià)分子量測(cè)定準(zhǔn)確性。
1.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析
1.5.1 最優(yōu)電泳參數(shù)確定
正交實(shí)驗(yàn)極差分析結(jié)果顯示，電壓是影響分離效果的最顯著因素（P＜0.01），電泳時(shí)間次之（P＜0.05），電流對(duì)分離效果影響較小（P＞0.05）。不同樣本類型的最優(yōu)參數(shù)及核心指標(biāo)如下表所示：
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樣本類型
|
最優(yōu)參數(shù)組合
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分辨率（R）
|
遷移速率（mm/min）
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RSD（%）
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DL2000核酸Marker
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恒壓120V，電流50mA，45min
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1.82
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0.85
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1.3
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小鼠肝臟基因組DNA
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恒壓80V，電流30mA，60min
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1.56
|
0.42
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1.1
|
|
HeLa細(xì)胞總蛋白
|
濃縮膠80V，分離膠120V，80min
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1.95
|
0.38
|
1.5
|
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BSA標(biāo)準(zhǔn)品
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濃縮膠80V，分離膠120V，70min
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2.03
|
0.40
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1.2
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以DL2000核酸Marker分離為例，部分正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下表所示：
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實(shí)驗(yàn)號(hào)
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電壓（V）
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電流（mA）
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時(shí)間（min）
|
分辨率（R）
|
RSD（%）
|
|
3
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80（A1）
|
70（B3）
|
45（C2）
|
1.45
|
2.1
|
|
5
|
120（A2）
|
50（B2）
|
45（C2）
|
1.82
|
1.3
|
|
7
|
160（A3）
|
50（B2）
|
30（C1）
|
1.63
|
1.8
|
