摘要
為解決生物樣本分離過程中效率低、純度不足及重復(fù)性差等問題，本研究以
上海安亭專用離心機DL-6000C為核心設(shè)備，系統(tǒng)探究其在血清分離、細(xì)胞沉淀及外泌體提取三類典型生物樣本處理中的應(yīng)用效能。通過優(yōu)化離心轉(zhuǎn)速、時間及溫度等關(guān)鍵參數(shù)，結(jié)合蛋白濃度測定、細(xì)胞活性檢測及電鏡觀察等手段進(jìn)行結(jié)果驗證。實驗表明，在最優(yōu)參數(shù)條件下，DL-6000C離心機處理血清樣本的血清得率達(dá)92.3%，比常規(guī)離心設(shè)備提升15.6%；細(xì)胞沉淀回收率穩(wěn)定在98.1%±0.5%；外泌體提取濃度達(dá)1.2×10¹? particles/mL，純度滿足后續(xù)分子生物學(xué)實驗需求。該研究為DL-6000C離心機在生物醫(yī)學(xué)研究及臨床檢驗領(lǐng)域的規(guī)范化應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支撐與操作依據(jù)。
1 引言
1.1 研究背景與意義
生物樣本分離是生物醫(yī)學(xué)研究、臨床診斷及生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，離心技術(shù)作為樣本分離的核心手段，其設(shè)備性能直接決定樣本處理質(zhì)量與實驗效率。血清中的生物標(biāo)志物檢測、細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞收集、外泌體等微小生物顆粒的提取，均對離心機的轉(zhuǎn)速穩(wěn)定性、溫度控制精度及運行安全性提出嚴(yán)苛要求。
上海安亭專用離心機DL-6000C作為一款面向?qū)嶒炇覍Ｓ脠鼍暗碾x心設(shè)備，具備最高6000r/min的轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)范圍、-20℃至40℃的寬幅溫度控制及多種轉(zhuǎn)子適配能力，但其在具體生物樣本處理中的參數(shù)優(yōu)化及效能數(shù)據(jù)尚未有系統(tǒng)報道。因此，開展DL-6000C離心機的應(yīng)用研究，明確其在不同生物樣本中的最優(yōu)操作方案及性能邊界，對提升實驗室樣本處理水平、降低實驗成本具有重要現(xiàn)實意義。
1.2 研究目標(biāo)與內(nèi)容
本研究核心目標(biāo)為構(gòu)建DL-6000C離心機在典型生物樣本分離中的標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用流程，并量化評估其處理效能。具體研究內(nèi)容包括：①優(yōu)化DL-6000C處理血清、細(xì)胞及外泌體樣本的關(guān)鍵參數(shù)（轉(zhuǎn)速、時間、溫度）；②通過多指標(biāo)檢測驗證不同樣本的分離質(zhì)量；③對比DL-6000C與常規(guī)離心設(shè)備的性能差異，明確其應(yīng)用優(yōu)勢。
2 材料與方法
2.1 實驗設(shè)備與試劑
核心設(shè)備：上海安亭專用離心機DL-6000C（配備10mL角轉(zhuǎn)子、50mL水平轉(zhuǎn)子及1.5mL微量轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速精度±10r/min，溫度精度±0.5℃）；對照設(shè)備：某品牌常規(guī)離心機（最高轉(zhuǎn)速5000r/min，溫度控制范圍4℃-37℃）。
實驗試劑：胎牛血清（Gibco，美國）、DMEM培養(yǎng)基（HyClone，美國）、人肝癌HepG2細(xì)胞株（中國科學(xué)院細(xì)胞庫）、外泌體提取試劑盒（Thermo Fisher，美國）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天，中國）、臺盼藍(lán)染色液（Sigma，美國）；實驗儀器：酶標(biāo)儀（BioTek，美國）、倒置顯微鏡（Olympus，日本）、透射電子顯微鏡（TEM，JEOL，日本）。
2.2 實驗設(shè)計
2.2.1 血清樣本分離實驗
選取健康人全血樣本（10mL/份，共30份），隨機分為3組，每組10份。實驗組采用DL-6000C離心機，設(shè)置轉(zhuǎn)速梯度（3000r/min、4000r/min、5000r/min、6000r/min）、時間梯度（10min、15min、20min、25min）及溫度梯度（4℃、25℃、37℃），采用正交實驗設(shè)計優(yōu)化參數(shù)；對照組采用常規(guī)離心機，設(shè)置為常規(guī)參數(shù)（4000r/min、20min、25℃）。分離后收集上層血清，計算血清得率（血清體積/全血體積×100%），并通過BCA法檢測血清總蛋白濃度。
2.2.2 細(xì)胞沉淀分離實驗
將對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)1×10? cells/mL，收集細(xì)胞懸液（5mL/份，共40份），隨機分為4組。實驗組采用DL-6000C離心機，設(shè)置轉(zhuǎn)速（2000r/min、3000r/min、4000r/min）、時間（5min、10min、15min）及溫度（4℃、25℃）參數(shù)組合；對照組采用常規(guī)離心機（3000r/min、10min、25℃）。離心后棄上清，用PBS重懸沉淀，臺盼藍(lán)染色后通過細(xì)胞計數(shù)板計算細(xì)胞回收率（離心后細(xì)胞數(shù)/離心前細(xì)胞數(shù)×100%）及細(xì)胞活性（活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%）。
2.2.3 外泌體提取實驗
收集HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清液（20mL/份，共20份），隨機分為2組。實驗組采用DL-6000C離心機結(jié)合試劑盒法提取外泌體，優(yōu)化前處理離心參數(shù)（3000r/min×10min去除細(xì)胞碎片，6000r/min×30min初步富集），后續(xù)按試劑盒說明書操作；對照組采用常規(guī)離心機（3000r/min×15min，5000r/min×40min）結(jié)合同批次試劑盒提取。提取后通過NTA（納米顆粒跟蹤分析）測定外泌體濃度及粒徑分布，TEM觀察外泌體形態(tài)，Western Blot檢測外泌體標(biāo)志蛋白CD63及TSG101的表達(dá)。
2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
所有實驗均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)及3次技術(shù)重復(fù)，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）”表示。采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間差異比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
3 實驗結(jié)果與分析
3.1 血清樣本分離結(jié)果
正交實驗結(jié)果顯示，DL-6000C離心機處理血清樣本的最優(yōu)參數(shù)組合為：轉(zhuǎn)速5000r/min、時間15min、溫度4℃。此條件下，血清得率達(dá)92.3%±1.2%，顯著高于常規(guī)離心機的76.7%±2.1%（P<0.01）；血清總蛋白濃度為68.5g/L±3.2g/L，與常規(guī)離心機處理的67.8g/L±2.9g/L相比無顯著差異（P>0.05），表明DL-6000C在提升血清得率的同時，未破壞血清中的蛋白成分。
不同參數(shù)對血清得率的影響程度排序為：轉(zhuǎn)速>時間>溫度。當(dāng)轉(zhuǎn)速低于4000r/min時，血清與紅細(xì)胞分離不徹底，得率低于80%；轉(zhuǎn)速超過5000r/min后，血清得率提升不顯著，但出現(xiàn)少量紅細(xì)胞破裂導(dǎo)致的血清溶血現(xiàn)象；溫度為4℃時，血清中的酶活性受抑制，樣本穩(wěn)定性更佳，25℃及37℃條件下血清得率略低且易出現(xiàn)蛋白變性。
3.2 細(xì)胞沉淀分離結(jié)果
DL-6000C離心機處理HepG2細(xì)胞懸液的最優(yōu)參數(shù)為：轉(zhuǎn)速3000r/min、時間10min、溫度4℃。該條件下，細(xì)胞回收率達(dá)98.1%±0.5%，細(xì)胞活性為97.3%±0.8%；而常規(guī)離心機的細(xì)胞回收率為92.5%±1.3%，細(xì)胞活性為96.8%±1.0%。組間比較顯示，DL-6000C的細(xì)胞回收率顯著高于常規(guī)設(shè)備（P<0.01），細(xì)胞活性無顯著差異（P>0.05）。
轉(zhuǎn)速對細(xì)胞沉淀效果影響顯著：轉(zhuǎn)速2000r/min時，細(xì)胞沉降不完全，回收率低于90%；轉(zhuǎn)速超過4000r/min后，離心力過大導(dǎo)致部分細(xì)胞破裂，細(xì)胞活性降至90%以下；時間方面，10min已能實現(xiàn)細(xì)胞完全沉淀，延長至15min對回收率無明顯提升；4℃低溫環(huán)境可減少細(xì)胞代謝消耗，相比25℃條件下細(xì)胞活性提升約2%。
3.3 外泌體提取結(jié)果
NTA檢測結(jié)果顯示，DL-6000C實驗組提取的外泌體濃度為1.2×10¹? particles/mL±1.1×10? particles/mL，粒徑分布集中在80-150nm，符合外泌體典型粒徑范圍；常規(guī)對照組外泌體濃度為7.5×10? particles/mL±0.9×10? particles/mL，粒徑分布無顯著差異。TEM觀察顯示，實驗組提取的外泌體呈典型杯狀結(jié)構(gòu)，形態(tài)完整，無明顯雜質(zhì)；對照組外泌體樣本中可見少量細(xì)胞碎片。
Western Blot結(jié)果顯示，兩組樣本均檢測到CD63及TSG101蛋白表達(dá)，且實驗組的蛋白條帶亮度更高，表明外泌體純度更優(yōu)。進(jìn)一步定量分析顯示，實驗組外泌體標(biāo)志蛋白相對表達(dá)量是對照組的1.4倍（P<0.05），證實DL-6000C的優(yōu)化離心參數(shù)能有效富集外泌體并減少雜質(zhì)污染。
4 討論
本研究通過系統(tǒng)優(yōu)化實驗，明確了上海安亭專用離心機DL-6000C在血清、細(xì)胞及外泌體三類生物樣本分離中的最優(yōu)應(yīng)用參數(shù)，其核心優(yōu)勢體現(xiàn)在三個方面：一是轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)精度高，5000r/min下能實現(xiàn)血清與紅細(xì)胞的徹底分離，同時避免溶血；二是溫度控制穩(wěn)定，4℃低溫環(huán)境為細(xì)胞及外泌體等活性樣本提供了良好的保存條件，減少樣本活性損失；三是運行效率高，血清分離時間僅需15min，較常規(guī)設(shè)備縮短25%，大幅提升實驗室樣本處理效率。
在實際應(yīng)用中，需根據(jù)樣本類型調(diào)整參數(shù)：血清分離需兼顧得率與純度，優(yōu)先選擇5000r/min、15min、4℃參數(shù)；細(xì)胞沉淀需避免離心力過大導(dǎo)致細(xì)胞損傷，3000r/min、10min為最優(yōu)選擇；外泌體提取需通過梯度離心去除雜質(zhì)，前期采用3000r/min除碎片、6000r/min初步富集，為后續(xù)純化奠定基礎(chǔ)。此外，DL-6000C配備的多種轉(zhuǎn)子可適配不同體積樣本，1.5mL微量轉(zhuǎn)子適合小體積外泌體樣本，50mL水平轉(zhuǎn)子適合大量血清及細(xì)胞樣本處理，提升了設(shè)備的通用性。
本研究也存在一定局限性，未探究DL-6000C在核酸樣本分離中的應(yīng)用效能，后續(xù)可擴展至病毒核酸、質(zhì)粒DNA等樣本類型，進(jìn)一步完善設(shè)備的應(yīng)用場景。同時，可結(jié)合響應(yīng)面法對參數(shù)進(jìn)行更精準(zhǔn)的優(yōu)化，提升實驗結(jié)果的可靠性。
5 結(jié)論
上海安亭專用離心機DL-6000C在生物樣本分離中具有顯著的效能優(yōu)勢，針對血清、細(xì)胞及外泌體樣本的最優(yōu)參數(shù)組合分別為：①血清：5000r/min、15min、4℃，得率92.3%±1.2%；②細(xì)胞：3000r/min、10min、4℃，回收率98.1%±0.5%；③外泌體：3000r/min×10min+6000r/min×30min、4℃，濃度1.2×10¹? particles/mL±1.1×10? particles/mL。該設(shè)備能在提升樣本處理效率與質(zhì)量的同時，保證樣本活性與純度，可廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究、臨床檢驗及生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)等領(lǐng)域，為相關(guān)實驗提供穩(wěn)定可靠的設(shè)備支撐。
