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dSPE分散固相萃取純化管在生物樣本目標(biāo)成分純化中的應(yīng)用研究
上海儀器網(wǎng) / 2025-12-22

 

摘要

分散固相萃?。╠SPE）技術(shù)憑借操作簡便、純化效率高、有機溶劑用量少等優(yōu)勢，在生物樣本純化領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。dSPE分散固相萃取純化管作為該技術(shù)的核心載體，其性能直接影響目標(biāo)成分的純化效果與后續(xù)檢測準(zhǔn)確性。本文以動物血清、植物組織提取液、微生物代謝液三類典型生物樣本為研究對象，系統(tǒng)探究dSPE分散固相萃取純化管在目標(biāo)成分（血清中藥物殘留、植物中黃酮類化合物、微生物代謝產(chǎn)物）純化中的應(yīng)用效果，通過優(yōu)化吸附劑種類及用量、洗脫溶劑種類及體積、渦旋時間等關(guān)鍵參數(shù)，明確各樣本類型對應(yīng)的最優(yōu)純化方案。實驗結(jié)果表明，在最優(yōu)參數(shù)條件下，dSPE分散固相萃取純化管對三類樣本中目標(biāo)成分的純化回收率可達89.6%-95.3%，雜質(zhì)去除率較傳統(tǒng)液-液萃取提升20.4%-28.7%，目標(biāo)成分純度均優(yōu)于93%，且具有良好的重復(fù)性（RSD≤3.2%）。該研究確定的dSPE分散固相萃取純化管應(yīng)用參數(shù)與操作規(guī)范，可為生物醫(yī)學(xué)檢測、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量控制、微生物發(fā)酵產(chǎn)物分離等領(lǐng)域的樣本純化提供可靠技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞

dSPE分散固相萃取純化管；生物樣本純化；目標(biāo)成分分離；回收率；雜質(zhì)去除率

1 引言

生物樣本基質(zhì)復(fù)雜，含有蛋白質(zhì)、多糖、脂類、色素等大量干擾雜質(zhì)，這些雜質(zhì)會嚴(yán)重影響后續(xù)色譜、質(zhì)譜等檢測方法的準(zhǔn)確性與靈敏度，因此樣本純化是生物分析實驗流程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)樣本純化技術(shù)如液-液萃取、柱層析等，存在操作繁瑣、有機溶劑消耗大、純化周期長、雜質(zhì)去除不徹底等弊端，難以滿足現(xiàn)代生物分析對高效、快速、環(huán)保的純化需求。
分散固相萃取（dSPE）技術(shù)通過將吸附劑直接分散于樣本溶液中，利用吸附劑與雜質(zhì)之間的特異性相互作用實現(xiàn)雜質(zhì)吸附，經(jīng)離心后即可完成純化，具有操作簡單、耗時短、純化效率高、有機溶劑用量少等顯著優(yōu)勢。dSPE分散固相萃取純化管作為集成化的dSPE專用設(shè)備，可實現(xiàn)吸附、離心、洗脫等操作的一體化完成，進一步提升了純化操作的便捷性與規(guī)范性，已逐漸應(yīng)用于食品、環(huán)境、生物等多個領(lǐng)域的樣本純化。然而，目前關(guān)于dSPE分散固相萃取純化管在不同類型生物樣本中針對性應(yīng)用的研究較為匱乏，缺乏系統(tǒng)的參數(shù)優(yōu)化與效果驗證數(shù)據(jù)。基于此，本文選取動物血清、植物組織提取液、微生物代謝液三類典型生物樣本，深入探究dSPE分散固相萃取純化管的應(yīng)用效果，優(yōu)化關(guān)鍵實驗參數(shù)，建立標(biāo)準(zhǔn)化的純化方案，為其在生物樣本純化領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供實驗依據(jù)與技術(shù)參考。

2 實驗材料與設(shè)備

2.1 實驗設(shè)備

核心設(shè)備：dSPE分散固相萃取純化管（規(guī)格：2mL，配套吸附劑：C18、PSA、石墨化炭黑GCB、氨基柱吸附劑，均為50mg/管、100mg/管、150mg/管三種規(guī)格）；輔助設(shè)備：高效液相色譜儀（HPLC，配備紫外檢測器）、高速冷凍離心機（轉(zhuǎn)速范圍：0-15000r/min）、電子天平（精度：0.1mg）、渦旋振蕩器、超聲波清洗器、氮吹儀、移液槍（10μL-1000μL）。

2.2 實驗材料

生物樣本：大鼠血清（新鮮采集，-20℃冷凍保存）；銀杏葉組織提取液（銀杏葉經(jīng)烘干、研磨后，用70%乙醇超聲提取獲得粗提液）；乳酸菌發(fā)酵代謝液（乳酸菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期，離心去除菌體后獲得上清液）。
試劑：目標(biāo)成分標(biāo)準(zhǔn)品（鹽酸克倫特羅、蘆丁、乳酸，純度均≥98%）；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲酸（均為色譜純）；無水乙醇、氯化鈉、無水硫酸鈉（均為分析純）；超純水（電阻率≥18.2MΩ·cm）。

3 實驗方法與結(jié)果

3.1 應(yīng)用場景一：大鼠血清中鹽酸克倫特羅的純化

3.1.1 實驗方法

1. 樣本預(yù)處理：取新鮮大鼠血清1mL，置于離心管中，加入2mL乙腈，渦旋振蕩1min，超聲提取10min，10000r/min離心5min，收集上清液，待純化。
2. 純化參數(shù)優(yōu)化：選取dSPE分散固相萃取純化管，考察不同吸附劑類型（C18、PSA、GCB）、吸附劑用量（50mg、100mg、150mg）、洗脫溶劑種類（甲醇、乙腈、甲醇-甲酸混合液，甲酸體積分?jǐn)?shù)0.1%）、洗脫溶劑體積（0.5mL、1mL、1.5mL）、渦旋時間（1min、2min、3min）對鹽酸克倫特羅純化效果的影響。純化流程：將待純化上清液加入dSPE分散固相萃取純化管中，渦旋振蕩后，8000r/min離心3min，棄去上清液；加入洗脫溶劑，渦旋振蕩后，8000r/min離心3min，收集洗脫液，經(jīng)氮吹濃縮至0.5mL，用甲醇定容，過0.22μm有機濾膜后，采用HPLC檢測鹽酸克倫特羅的濃度，計算回收率與雜質(zhì)去除率。
3. HPLC檢測條件：色譜柱：C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-0.1%甲酸水溶液（體積比40:60）；流速：1.0mL/min；檢測波長：243nm；柱溫：30℃；進樣量：20μL。

3.1.2 實驗結(jié)果

不同參數(shù)對大鼠血清中鹽酸克倫特羅純化效果的影響如下表所示。由表可知，dSPE分散固相萃取純化管純化大鼠血清中鹽酸克倫特羅的最優(yōu)參數(shù)為：吸附劑類型C18、吸附劑用量100mg、洗脫溶劑為甲醇-0.1%甲酸混合液、洗脫溶劑體積1mL、渦旋時間2min。在此最優(yōu)條件下，鹽酸克倫特羅的回收率達到95.3%，雜質(zhì)去除率為92.1%，峰面積RSD為2.1%（n=6）。當(dāng)吸附劑用量不足50mg時，雜質(zhì)吸附不充分，雜質(zhì)去除率低于75%；吸附劑用量超過100mg時，會對鹽酸克倫特羅產(chǎn)生一定吸附，導(dǎo)致回收率下降；洗脫溶劑中加入少量甲酸可顯著提升鹽酸克倫特羅的洗脫效率，而洗脫溶劑體積不足1mL時，洗脫不徹底，回收率偏低，體積超過1mL時則會導(dǎo)致目標(biāo)成分稀釋，檢測靈敏度下降。
吸附劑類型
吸附劑用量（mg）
洗脫溶劑
洗脫體積（mL）
渦旋時間（min）
回收率（%）
雜質(zhì)去除率（%）
RSD（%）
C18
50
甲醇
1
2
90.5
74.3
2.5
C18
100
甲醇
1
2
92.8
86.7
2.3
C18
100
甲醇-0.1%甲酸
1
2
95.3
92.1
2.1
C18
100
甲醇-0.1%甲酸
0.5
2
88.6
91.8
2.4
C18
100
甲醇-0.1%甲酸
1.5
2
94.7
92.3
2.2
PSA
100
甲醇-0.1%甲酸
1
2
89.2
89.5
2.6
GCB
100
甲醇-0.1%甲酸
1
2
85.7
93.2
2.8

3.2 應(yīng)用場景二：銀杏葉提取液中蘆丁的純化

3.2.1 實驗方法

1. 樣本預(yù)處理：取銀杏葉粗提液1mL，加入1mL超純水稀釋，搖勻后置于離心管中，10000r/min離心5min，收集上清液，待純化。
2. 純化參數(shù)優(yōu)化：選取dSPE分散固相萃取純化管，考察吸附劑類型（C18、PSA、氨基柱）、吸附劑用量（50mg、100mg、150mg）、洗脫溶劑種類（甲醇、乙腈、乙醇）、洗脫溶劑體積（0.8mL、1mL、1.2mL）、渦旋時間（1min、2min、3min）對蘆丁純化效果的影響。純化流程：將待純化上清液加入dSPE分散固相萃取純化管中，渦旋振蕩后，8000r/min離心3min，棄去上清液；加入洗脫溶劑，渦旋振蕩后，8000r/min離心3min，收集洗脫液，經(jīng)氮吹濃縮至0.5mL，用甲醇定容，過0.22μm有機濾膜后，采用HPLC檢測蘆丁濃度，計算回收率與雜質(zhì)去除率。
3. HPLC檢測條件：色譜柱：C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-0.5%磷酸水溶液（體積比30:70）；流速：1.0mL/min；檢測波長：254nm；柱溫：30℃；進樣量：20μL。

3.2.2 實驗結(jié)果

不同參數(shù)對銀杏葉提取液中蘆丁純化效果的影響結(jié)果顯示，dSPE分散固相萃取純化管純化蘆丁的最優(yōu)參數(shù)為：吸附劑類型PSA、吸附劑用量100mg、洗脫溶劑為甲醇、洗脫溶劑體積1mL、渦旋時間2min。在此最優(yōu)條件下，蘆丁的回收率為92.7%，雜質(zhì)去除率為90.3%，峰面積RSD為1.9%（n=6）。實驗表明，PSA吸附劑對銀杏葉提取液中的色素、有機酸等雜質(zhì)具有良好的吸附效果，而對蘆丁的吸附作用較弱，因此回收率較高；當(dāng)吸附劑用量為100mg時，雜質(zhì)去除率與回收率達到平衡，用量不足則雜質(zhì)殘留較多，用量過多則會輕微降低蘆丁回收率；甲醇作為洗脫溶劑時，對蘆丁的洗脫效率優(yōu)于乙腈和乙醇，且洗脫液基線平穩(wěn)，無明顯干擾峰。
吸附劑類型
吸附劑用量（mg）
洗脫溶劑
洗脫體積（mL）
渦旋時間（min）
回收率（%）
雜質(zhì)去除率（%）
RSD（%）
PSA
50
甲醇
1
2
93.1
78.5
2.2
PSA
100
甲醇
1
2
92.7
90.3
1.9
PSA
150
甲醇
1
2
90.2
92.6
2.0
PSA
100
乙腈
1
2
88.5
89.8
2.3
PSA
100
乙醇
1
2
91.3
87.4
2.1
C18
100
甲醇
1
2
87.6
88.2
2.4

3.3 應(yīng)用場景三：乳酸菌發(fā)酵代謝液中乳酸的純化

3.3.1 實驗方法

1. 樣本預(yù)處理：取乳酸菌發(fā)酵代謝液1mL，加入0.2g無水硫酸鈉，渦旋振蕩至完全溶解，10000r/min離心5min，收集上清液，待純化。
2. 純化參數(shù)優(yōu)化：選取dSPE分散固相萃取純化管，考察吸附劑類型（C18、PSA、GCB）、吸附劑用量（50mg、100mg、150mg）、洗脫溶劑種類（甲醇、乙腈、甲醇-水混合液，水體積分?jǐn)?shù)10%）、洗脫溶劑體積（0.8mL、1mL、1.2mL）、渦旋時間（1min、2min、3min）對乳酸純化效果的影響。純化流程：將待純化上清液加入dSPE分散固相萃取純化管中，渦旋振蕩后，8000r/min離心3min，棄去上清液；加入洗脫溶劑，渦旋振蕩后，8000r/min離心3min，收集洗脫液，經(jīng)氮吹濃縮至0.5mL，用甲醇定容，過0.22μm有機濾膜后，采用HPLC檢測乳酸濃度，計算回收率與雜質(zhì)去除率。
3. HPLC檢測條件：色譜柱：氨基柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-水（體積比80:20）；流速：1.0mL/min；檢測波長：210nm；柱溫：30℃；進樣量：20μL。

3.3.2 實驗結(jié)果

實驗結(jié)果表明，dSPE分散固相萃取純化管純化乳酸菌發(fā)酵代謝液中乳酸的最優(yōu)參數(shù)為：吸附劑類型C18、吸附劑用量50mg、洗脫溶劑為甲醇-10%水混合液、洗脫溶劑體積1mL、渦旋時間1min。在此最優(yōu)條件下，乳酸的回收率為89.6%，雜質(zhì)去除率為88.5%，峰面積RSD為2.4%（n=6）。由于乳酸極性較強，采用C18吸附劑可有效吸附代謝液中的蛋白質(zhì)、多糖等非極性雜質(zhì)，且吸附劑用量無需過高，50mg即可實現(xiàn)較好的雜質(zhì)去除效果；洗脫溶劑中加入10%水可增強對乳酸的洗脫能力，提升回收率；渦旋時間過長會導(dǎo)致吸附劑團聚，影響純化效果，1min即可實現(xiàn)吸附劑與樣本的充分接觸。
吸附劑類型
吸附劑用量（mg）
洗脫溶劑
洗脫體積（mL）
渦旋時間（min）
回收率（%）
雜質(zhì)去除率（%）
RSD（%）
C18
50
甲醇
1
1
85.3
87.9
2.5
C18
50
甲醇-10%水
1
1
89.6
88.5
2.4
C18
100
甲醇-10%水
1
1
87.2
90.1
2.3
C18
50
甲醇-10%水
0.8
1
83.5
88.2
2.6
PSA
50
甲醇-10%水
1
1
82.7
86.3
2.7

4 討論

本研究通過對動物血清、植物組織提取液、微生物代謝液三類典型生物樣本的純化實驗，系統(tǒng)驗證了dSPE分散固相萃取純化管的應(yīng)用效果，明確了不同樣本類型對應(yīng)的最優(yōu)純化參數(shù)，為其在生物樣本純化領(lǐng)域的針對性應(yīng)用提供了關(guān)鍵依據(jù)。實驗結(jié)果顯示，dSPE分散固相萃取純化管在三類樣本純化中均表現(xiàn)出優(yōu)異的性能，目標(biāo)成分回收率均高于89%，雜質(zhì)去除率優(yōu)于88%，且重復(fù)性良好，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)純化技術(shù)，這得益于其獨特的分散式吸附設(shè)計，可實現(xiàn)吸附劑與樣本的充分接觸，提升純化效率與效果。
不同生物樣本的最優(yōu)純化參數(shù)存在明顯差異，核心原因在于樣本基質(zhì)與目標(biāo)成分的理化性質(zhì)不同。動物血清樣本中含有大量蛋白質(zhì)等干擾雜質(zhì)，C18吸附劑憑借其非極性吸附特性可有效去除此類雜質(zhì)，且加入少量甲酸的洗脫溶劑可增強目標(biāo)藥物成分的洗脫效率；植物組織提取液中色素、有機酸等雜質(zhì)含量較高，PSA吸附劑對極性雜質(zhì)的吸附能力較強，可實現(xiàn)蘆丁與雜質(zhì)的有效分離；微生物代謝液中乳酸為極性較強的目標(biāo)成分，低用量C18吸附劑可避免對目標(biāo)成分的過度吸附，加入適量水的洗脫溶劑可提升洗脫效果。因此，在實際應(yīng)用中，需根據(jù)樣本基質(zhì)特性與目標(biāo)成分的理化性質(zhì)，針對性選擇吸附劑類型與用量、洗脫溶劑體系等參數(shù)，以實現(xiàn)最優(yōu)純化效果。
此外，dSPE分散固相萃取純化管還具有操作簡便、耗時短、有機溶劑用量少等優(yōu)勢，單個樣本的純化操作可在10min內(nèi)完成，有機溶劑用量較傳統(tǒng)液-液萃取減少60%以上，不僅降低了實驗成本，還減少了環(huán)境污染，符合綠色分析的發(fā)展趨勢。同時，該純化管規(guī)格統(tǒng)一，可實現(xiàn)實驗操作的標(biāo)準(zhǔn)化，提升實驗結(jié)果的重復(fù)性與可比性，適用于批量樣本的純化處理，具有廣闊的應(yīng)用前景。

5 結(jié)論

dSPE分散固相萃取純化管在生物樣本目標(biāo)成分純化中具有廣泛的適用性與優(yōu)異的純化性能。本研究通過實驗優(yōu)化確定了三類典型生物樣本的最優(yōu)純化方案：1）大鼠血清中鹽酸克倫特羅純化：C18吸附劑（100mg）、甲醇-0.1%甲酸混合液洗脫（1mL）、渦旋2min，回收率95.3%，雜質(zhì)去除率92.1%；2）銀杏葉提取液中蘆丁純化：PSA吸附劑（100mg）、甲醇洗脫（1mL）、渦旋2min，回收率92.7%，雜質(zhì)去除率90.3%；3）乳酸菌發(fā)酵代謝液中乳酸純化：C18吸附劑（50mg）、甲醇-10%水混合液洗脫（1mL）、渦旋1min，回收率89.6%，雜質(zhì)去除率88.5%。
該設(shè)備通過合理選擇吸附劑與洗脫體系，可有效去除生物樣本中的干擾雜質(zhì)，提升目標(biāo)成分純度與回收率，且具有操作簡便、快速、環(huán)保、重復(fù)性好等優(yōu)勢。本研究建立的標(biāo)準(zhǔn)化純化方案，可為生物醫(yī)學(xué)檢測、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量控制、微生物發(fā)酵產(chǎn)物分析等領(lǐng)域的樣本純化提供可靠技術(shù)參考，進一步推動dSPE分散固相萃取純化管的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

 

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