一、引言

二、NH2氨基SPE小柱SBEQ-CA2154核心參數(shù)與工作原理

2.1 核心技術(shù)參數(shù)

2.2 工作原理

三、NH2氨基SPE小柱SBEQ-CA2154應(yīng)用方案設(shè)計(jì)

3.1 應(yīng)用場(chǎng)景與實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

• 建立基于NH2氨基SPE小柱SBEQ-CA2154的生物樣品前處理方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)血漿、尿液樣品中黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素的高效富集；
• 驗(yàn)證該方法的凈化效果，有效去除樣品中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、有機(jī)酸等干擾物質(zhì)，保障后續(xù)高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)的準(zhǔn)確性；
• 對(duì)方法學(xué)性能進(jìn)行驗(yàn)證，包括回收率、精密度、檢出限、定量限等，評(píng)估該前處理方法的可靠性與適用性。

3.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料

• 核心材料：NH2氨基SPE小柱SBEQ-CA2154（規(guī)格：3 mL/100 mg，上海某生物科技有限公司）；
• 標(biāo)準(zhǔn)品：黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.0%）、嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.0%）；
• 生物樣品：健康人血漿、尿液（經(jīng)倫理審批后收集）；
• 試劑：甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、正己烷（分析純）、乙酸銨（分析純）、甲酸（分析純）、超純水（18.2 MΩ·cm）；
• 其他：0.22 μm有機(jī)相濾膜、離心管（50 mL、1.5 mL）。

3.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器

• 固相萃取裝置（含真空抽濾系統(tǒng)）；
• 高效液相色譜儀（配熒光檢測(cè)器、紫外檢測(cè)器）；
• 高速冷凍離心機(jī)（GL-21C）；
• 電子分析天平（精度0.1 mg）；
• 渦旋振蕩器；
• 氮吹儀。

3.3 具體實(shí)驗(yàn)方案

3.3.1 樣品預(yù)處理

1. 血漿樣品預(yù)處理：取1 mL血漿樣品置于50 mL離心管中，加入3 mL乙腈，渦旋振蕩2 min，充分沉淀蛋白質(zhì)；隨后以12000 r/min、4℃離心10 min，吸取上清液至另一離心管中，加入2 mL超純水稀釋，渦旋混勻，待上樣；
2. 尿液樣品預(yù)處理：取2 mL尿液樣品置于50 mL離心管中，加入1 mL甲醇，渦旋振蕩1 min，以8000 r/min、4℃離心5 min，吸取上清液，直接待上樣（尿液基質(zhì)相對(duì)簡(jiǎn)單，無需額外沉淀蛋白質(zhì)）。

3.3.2 SPE小柱操作步驟（以3 mL/100 mg SBEQ-CA2154小柱為例）

1. 活化：向NH2氨基SPE小柱中加入3 mL甲醇，開啟真空抽濾，控制流速為1 - 2 mL/min，待甲醇完全流盡；
2. 平衡：加入3 mL 0.05 mol/L乙酸銨緩沖液（pH=7.0），同樣以1 - 2 mL/min流速流盡，平衡小柱填料至與樣品基質(zhì)兼容的pH環(huán)境；
3. 上樣：將預(yù)處理后的血漿或尿液樣品緩慢加入小柱中，控制流速1 mL/min，確保目標(biāo)化合物充分吸附于填料上；
4. 淋洗：先加入3 mL正己烷，流盡后再加入3 mL 5%甲醇水溶液（V/V），依次淋洗小柱，去除脂質(zhì)、殘留蛋白質(zhì)及部分酸性干擾物質(zhì)；淋洗完成后，繼續(xù)抽濾30 s，排盡小柱內(nèi)殘留液體；
5. 洗脫：加入3 mL含5%甲酸的乙腈溶液（V/V），以1 mL/min流速洗脫，收集洗脫液于1.5 mL離心管中；
6. 后續(xù)處理：將洗脫液置于氮吹儀中，40℃下氮吹至近干；加入1 mL甲醇復(fù)溶，渦旋振蕩1 min，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾后，供HPLC檢測(cè)。

3.3.3 HPLC檢測(cè)條件

• 色譜柱：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；
• 流動(dòng)相：A相為0.05 mol/L乙酸銨緩沖液，B相為乙腈；梯度洗脫程序：0 - 5 min，30% B；5 - 15 min，30% - 60% B；15 - 20 min，60% B；20 - 25 min，60% - 30% B；
• 流速：1.0 mL/min；
• 柱溫：30℃；
• 檢測(cè)條件：黃曲霉毒素B1采用熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)365 nm，發(fā)射波長(zhǎng)435 nm；嘔吐毒素采用紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；
• 進(jìn)樣量：20 μL。

3.3.4 方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

• 回收率實(shí)驗(yàn)：向空白血漿、尿液樣品中分別添加低、中、高三個(gè)濃度水平的黃曲霉毒素B1和嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品（低濃度：黃曲霉毒素B1 0.5 μg/L、嘔吐毒素5 μg/L；中濃度：黃曲霉毒素B1 2 μg/L、嘔吐毒素20 μg/L；高濃度：黃曲霉毒素B1 10 μg/L、嘔吐毒素100 μg/L），每個(gè)濃度水平設(shè)置6個(gè)平行樣品，按上述實(shí)驗(yàn)方案處理并檢測(cè)，計(jì)算加標(biāo)回收率；
• 精密度實(shí)驗(yàn)：選取中濃度加標(biāo)樣品，連續(xù)6天進(jìn)行前處理和檢測(cè)（日間精密度），同一批樣品中6個(gè)平行樣同時(shí)處理檢測(cè)（日內(nèi)精密度），計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）；
• 檢出限（LOD）與定量限（LOQ）：對(duì)空白樣品進(jìn)行11次平行檢測(cè)，以3倍信噪比（S/N=3）計(jì)算檢出限，以10倍信噪比（S/N=10）計(jì)算定量限。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

4.1 凈化效果驗(yàn)證結(jié)果

4.2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.4 檢出限與定量限結(jié)果

五、結(jié)論與建議

5.1 結(jié)論

• NH2氨基SPE小柱SBEQ-CA2154對(duì)生物樣品具有優(yōu)異的凈化效果，可有效去除血漿、尿液中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、酸性干擾物質(zhì)等，顯著改善HPLC色譜圖的基線穩(wěn)定性和目標(biāo)峰分離度，保障檢測(cè)準(zhǔn)確性；
• 該小柱對(duì)黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素具有良好的富集性能，在低、中、高三個(gè)濃度水平下的加標(biāo)回收率為85.2% - 96.4%，日內(nèi)和日間精密度RSD均≤4.5%，方法學(xué)性能優(yōu)異，符合生物樣品分析要求；
• 方法檢測(cè)靈敏度高，黃曲霉毒素B1檢出限低至0.10 μg/L，嘔吐毒素檢出限低至1.0 μg/L，可滿足生物樣品中低濃度極性目標(biāo)化合物的檢測(cè)需求，適用于臨床毒物檢測(cè)、食品安全監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域的生物樣品前處理工作。

5.2 建議

• 樣品處理方面：上樣前需確保樣品充分離心，去除沉淀雜質(zhì)，避免堵塞SPE小柱；對(duì)于粘度較大的生物樣品（如血漿），可適當(dāng)稀釋后再上樣，控制上樣流速在1 mL/min左右，確保目標(biāo)化合物充分吸附；
• 參數(shù)優(yōu)化方面：針對(duì)不同類型的目標(biāo)化合物（如不同極性的藥物、毒素），應(yīng)根據(jù)其化學(xué)性質(zhì)優(yōu)化淋洗液和洗脫液的種類及比例；對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)樣品，可增加淋洗步驟或調(diào)整淋洗液體積，進(jìn)一步提升凈化效果；
• 設(shè)備與耗材使用方面：SPE小柱使用前需確?；罨?、平衡充分，避免因填料未完全活化影響吸附容量；實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)使用配套的固相萃取裝置，精準(zhǔn)控制流速，保障實(shí)驗(yàn)重復(fù)性；
• 拓展應(yīng)用方面：后續(xù)可探索NH2氨基SPE小柱SBEQ-CA2154在其他生物樣品（如組織勻漿、腦脊液）及其他極性目標(biāo)化合物（如抗生素、農(nóng)藥殘留）中的應(yīng)用，進(jìn)一步擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。