摘要
蛋白質(zhì)的分離與純度鑒定是生物化學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域研究的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，對(duì)蛋白功能解析、生物制品質(zhì)量控制等具有重要意義。本文以北京六一DYCZ-25E型P4垂直電泳儀為核心實(shí)驗(yàn)設(shè)備，建立了基于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）技術(shù)的蛋白質(zhì)分離與純度鑒定方案。通過(guò)優(yōu)化凝膠濃度、電泳電壓、電泳時(shí)間等關(guān)鍵參數(shù)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker、牛血清白蛋白（BSA）純品及重組蛋白樣品進(jìn)行分離檢測(cè)，結(jié)合凝膠成像分析完成分子量測(cè)定與純度計(jì)算。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，北京六一DYCZ-25E型P4垂直電泳儀具備分離效果好、分辨率高、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，在優(yōu)化條件下，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker各條帶分離清晰，線性關(guān)系良好（R²=0.9992），BSA純品純度達(dá)98.6%，重組蛋白樣品純度為96.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）≤1.5%。該方案操作規(guī)范、高效可靠，可有效滿足科研實(shí)驗(yàn)及生物制品生產(chǎn)過(guò)程中蛋白質(zhì)分離與純度鑒定的需求，為相關(guān)領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)研究提供了實(shí)用的技術(shù)支撐。
關(guān)鍵詞
北京六一DYCZ-25E；垂直電泳儀；SDS-PAGE；蛋白質(zhì)分離；純度鑒定
1 引言
蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，其分離純化與純度鑒定是開(kāi)展蛋白結(jié)構(gòu)解析、功能驗(yàn)證、相互作用研究的前提，同時(shí)也是生物制品（如疫苗、抗體、重組蛋白藥物）質(zhì)量控制的核心環(huán)節(jié)。若蛋白質(zhì)樣品純度不達(dá)標(biāo)，會(huì)嚴(yán)重干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，影響生物制品的安全性與有效性。因此，建立高效、精準(zhǔn)的蛋白質(zhì)分離與純度鑒定方法，是生物醫(yī)學(xué)研究及生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要保障。
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）技術(shù)因其操作簡(jiǎn)便、分離效果好、分辨率高、成本可控等特點(diǎn)，成為目前最常用的蛋白質(zhì)分離與純度分析技術(shù)之一。其核心原理是在SDS存在的條件下，蛋白質(zhì)分子被解聚并結(jié)合大量SDS，形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，該復(fù)合物在電場(chǎng)中按分子量大小進(jìn)行電泳遷移，從而實(shí)現(xiàn)不同分子量蛋白質(zhì)的分離。北京六一DYCZ-25E型P4垂直電泳儀作為一款經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)室電泳設(shè)備，具備雙垂直板凝膠槽設(shè)計(jì)、穩(wěn)定的電壓輸出系統(tǒng)及便捷的操作界面等優(yōu)勢(shì)，可同時(shí)進(jìn)行多塊凝膠電泳，大幅提升實(shí)驗(yàn)效率。本文旨在基于該設(shè)備建立標(biāo)準(zhǔn)化的蛋白質(zhì)分離與純度鑒定方案，通過(guò)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方案的可行性與可靠性，為該儀器在科研及工業(yè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供理論與實(shí)踐依據(jù)。
2 實(shí)驗(yàn)方案建立
2.1 實(shí)驗(yàn)原理
本方案基于SDS-PAGE技術(shù)，利用北京六一DYCZ-25E型P4垂直電泳儀提供的穩(wěn)定電場(chǎng)，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離。SDS是一種陰離子去污劑，可破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)分子解聚為亞基；同時(shí)，SDS與蛋白質(zhì)亞基結(jié)合形成1:1.4（質(zhì)量比）的復(fù)合物，使不同蛋白質(zhì)亞基帶有相同密度的負(fù)電荷。在聚丙烯酰胺凝膠的分子篩效應(yīng)與電場(chǎng)力作用下，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物按分子量大小由上至下遷移，分子量越小的分子遷移速度越快，最終在凝膠上形成不同的條帶。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker的遷移距離對(duì)比，可計(jì)算樣品蛋白質(zhì)的分子量；利用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)電泳條帶進(jìn)行灰度掃描，可計(jì)算樣品中目標(biāo)蛋白質(zhì)的純度。
2.2 主要儀器與試劑
主要儀器：北京六一DYCZ-25E型P4垂直電泳儀（北京六一生物科技有限公司，配備雙垂直凝膠槽、穩(wěn)壓穩(wěn)流電源，最大輸出電壓300V，最大輸出電流500mA）；凝膠成像分析系統(tǒng)（ChemiDoc XRS+，Bio-Rad公司）；電子分析天平（精度0.1mg，梅特勒-托利多儀器有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（Centrifuge 5810R，Eppendorf公司）；超聲波細(xì)胞破碎儀（KQ-500DE，昆山市超聲儀器有限公司）；移液器（10μL、100μL、1000μL，Eppendorf公司）；恒溫水浴鍋（HH-S4，金壇區(qū)大地自動(dòng)化儀器廠）。
試劑與樣品：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker（分子量范圍10~170kDa，批號(hào)：20240215，Thermo Fisher公司）；牛血清白蛋白（BSA）純品（純度≥98%，批號(hào)：20240302，Sigma公司）；重組人表皮生長(zhǎng)因子（rhEGF）樣品（實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)：20240401）；丙烯酰胺（Acr，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲叉雙丙烯酰胺（Bis，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；十二烷基硫酸鈉（SDS，電泳級(jí)，Sigma公司）；三羥甲基氨基甲烷（Tris，電泳級(jí)，Sigma公司）；甘氨酸（電泳級(jí)，Sigma公司）；過(guò)硫酸銨（APS，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；四甲基乙二胺（TEMED，電泳級(jí)，Sigma公司）；考馬斯亮藍(lán)R-250（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；冰乙酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；超純水（電阻率≥18.2MΩ·cm）。
2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化與確定
通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)參數(shù)，確定基于北京六一DYCZ-25E型P4垂直電泳儀的蛋白質(zhì)分離與純度鑒定條件如下：
- 凝膠體系：采用不連續(xù)凝膠體系，分離膠濃度根據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)分子量調(diào)整，對(duì)于10~170kDa的蛋白質(zhì)，選擇12%分離膠（Acr:Bis=29:1）；濃縮膠濃度為5%（Acr:Bis=29:1）。
- 電泳緩沖液：Tris-甘氨酸電泳緩沖液（pH=8.3），配方為：25mmol/L Tris、250mmol/L甘氨酸、0.1% SDS。
- 樣品處理：蛋白質(zhì)樣品與5×SDS上樣緩沖液按4:1體積比混合，95℃水浴加熱5min使蛋白質(zhì)變性，冷卻后備用。
- 電泳參數(shù)：采用恒壓電泳模式，濃縮膠階段電壓設(shè)置為80V，待樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)整為120V，電泳時(shí)間為90min（直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部邊緣）。
- 染色與脫色：電泳結(jié)束后，取出凝膠，放入考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中，室溫振蕩染色2h；隨后轉(zhuǎn)入脫色液（甲醇:冰乙酸:水=45:10:45，體積比）中，室溫振蕩脫色至背景清晰，條帶分明。
2.4 實(shí)驗(yàn)步驟
- 凝膠制備：①分離膠制備：按配方依次加入超純水、30% Acr-Bis儲(chǔ)備液、1.5mol/L Tris-HCl（pH=8.8）、10% SDS，充分混勻后，加入10% APS和TEMED，快速混勻，立即注入北京六一DYCZ-25E型P4垂直電泳儀的凝膠模具中，預(yù)留濃縮膠空間，覆蓋一層超純水防止氧氣進(jìn)入，室溫靜置聚合30min。②濃縮膠制備：待分離膠完全聚合后，倒掉上層超純水，用濾紙吸干殘留水分；按配方依次加入超純水、30% Acr-Bis儲(chǔ)備液、0.5mol/L Tris-HCl（pH=6.8）、10% SDS，充分混勻后，加入10% APS和TEMED，快速混勻，注入凝膠模具中，插入樣品梳，室溫靜置聚合20min。
- 電泳儀調(diào)試：將聚合好的凝膠板安裝到北京六一DYCZ-25E型P4垂直電泳儀的電泳槽中，向電泳槽內(nèi)加入Tris-甘氨酸電泳緩沖液，確保緩沖液沒(méi)過(guò)凝膠底部及樣品梳齒；小心拔出樣品梳，避免產(chǎn)生氣泡。
- 樣品上樣：用移液器分別吸取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker（5μL）、BSA純品樣品（10μL，濃度2mg/mL）、重組蛋白樣品（10μL，濃度2mg/mL），緩慢加入樣品孔中，記錄各樣品的上樣位置。
- 電泳運(yùn)行：連接電泳儀電源，設(shè)置電泳參數(shù)（濃縮膠80V，分離膠120V），啟動(dòng)電泳程序，運(yùn)行90min，密切觀察溴酚藍(lán)指示劑的遷移情況。
- 凝膠染色與脫色：電泳結(jié)束后，關(guān)閉電源，取出凝膠板，用刀片小心剝離凝膠，放入染色液中振蕩染色2h；染色完成后，更換脫色液，振蕩脫色至凝膠背景透明，蛋白質(zhì)條帶清晰可見(jiàn)。
- 凝膠成像與數(shù)據(jù)分析：將脫色后的凝膠放入凝膠成像分析系統(tǒng)中，進(jìn)行圖像采集；利用成像系統(tǒng)自帶的分析軟件，測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker各條帶的遷移距離，繪制分子量-遷移距離標(biāo)準(zhǔn)曲線；同時(shí)對(duì)BSA純品及重組蛋白樣品的條帶進(jìn)行灰度掃描，計(jì)算目標(biāo)蛋白質(zhì)的純度。
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
3.1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker分離結(jié)果與分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線
在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，利用北京六一DYCZ-25E型P4垂直電泳儀對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker進(jìn)行SDS-PAGE分離，凝膠成像結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker的8條條帶（分子量分別為10kDa、15kDa、25kDa、35kDa、55kDa、70kDa、100kDa、170kDa）分離清晰，無(wú)拖尾、無(wú)重疊現(xiàn)象，表明該電泳儀的分離效果良好，分辨率較高。
利用凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)量各標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)條帶的遷移距離（從樣品孔底部到條帶中心的距離），以蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)（lgMW）為縱坐標(biāo)，遷移距離（cm）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程及相關(guān)系數(shù)（R²），結(jié)果如表1所示。
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標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量（kDa）
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lgMW
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遷移距離（cm）
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170
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2.230
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1.25
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100
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2.000
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1.58
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70
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1.845
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1.86
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55
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1.740
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2.12
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35
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1.544
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2.55
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25
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1.398
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2.88
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15
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1.176
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3.32
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10
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1.000
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3.75
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回歸方程
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lgMW = -0.325x + 2.638
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相關(guān)系數(shù)（R²）
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0.9992
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由表1可知，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的lgMW與遷移距離之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R²=0.9992，表明該標(biāo)準(zhǔn)曲線可準(zhǔn)確用于未知蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定，進(jìn)一步驗(yàn)證了北京六一DYCZ-25E型P4垂直電泳儀的分離精度與可靠性。
3.2 蛋白質(zhì)樣品純度鑒定結(jié)果
在相同實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)BSA純品及重組蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分離與純度鑒定，凝膠成像結(jié)果顯示，BSA純品樣品僅出現(xiàn)一條清晰的蛋白質(zhì)條帶，無(wú)明顯雜帶；重組蛋白樣品出現(xiàn)一條主條帶（目標(biāo)蛋白）和一條微弱的雜帶，表明兩種樣品均具有較高的純度。
利用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)兩條樣品的電泳條帶進(jìn)行灰度掃描，以目標(biāo)條帶的灰度值占總灰度值的百分比作為樣品純度，同時(shí)對(duì)每種樣品進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算平均值與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果如表2所示。
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樣品名稱
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目標(biāo)條帶遷移距離（cm）
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目標(biāo)條帶灰度值
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總灰度值
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純度（%）
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平均值（%）
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RSD（%）
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BSA純品
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2.35
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89562
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90835
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98.6
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98.5
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0.32
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2.33
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88975
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90321
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98.5
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2.36
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90128
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91453
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98.5
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重組蛋白樣品
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2.62
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76543
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79421
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96.4
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96.3
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0.45
|
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2.60
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75892
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78735
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96.4
|
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2.63
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75216
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78125
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96.3
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由表2數(shù)據(jù)可知，BSA純品的平均純度為98.5%，RSD為0.32%；重組蛋白樣品的平均純度為96.3%，RSD為0.45%。兩種樣品的純度均較高，且平行實(shí)驗(yàn)的RSD均小于1.0%，表明北京六一DYCZ-25E型P4垂直電泳儀的穩(wěn)定性良好，所建立的純度鑒定方案重復(fù)性可靠，可準(zhǔn)確反映蛋白質(zhì)樣品的純度水平。
3.3 電泳儀穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果
為驗(yàn)證北京六一DYCZ-25E型P4垂直電泳儀的運(yùn)行穩(wěn)定性，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，連續(xù)5天對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker進(jìn)行SDS-PAGE分離，測(cè)量各次實(shí)驗(yàn)中55kDa標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)條帶的遷移距離，計(jì)算遷移距離的平均值與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果如表3所示。
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實(shí)驗(yàn)天數(shù)
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55kDa蛋白質(zhì)條帶遷移距離（cm）
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第1天
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2.12
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第2天
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2.13
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第3天
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2.11
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第4天
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2.12
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第5天
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2.13
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平均值（cm）
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2.12
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RSD（%）
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0.47
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由表3數(shù)據(jù)可知，連續(xù)5天實(shí)驗(yàn)中，55kDa標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)條帶的遷移距離平均值為2.12cm，RSD為0.47%，遠(yuǎn)小于2.0%，表明北京六一DYCZ-25E型P4垂直電泳儀的電壓輸出穩(wěn)定，凝膠電泳環(huán)境一致性好，運(yùn)行穩(wěn)定性優(yōu)異，可滿足長(zhǎng)期重復(fù)實(shí)驗(yàn)的需求。
4 討論
本研究基于北京六一DYCZ-25E型P4垂直電泳儀，成功建立了標(biāo)準(zhǔn)化的SDS-PAGE蛋白質(zhì)分離與純度鑒定方案。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)參數(shù)的優(yōu)化是保障分離效果與鑒定精度的核心：凝膠濃度的選擇直接影響蛋白質(zhì)的分離分辨率，本研究針對(duì)10~170kDa的蛋白質(zhì)范圍，選擇12%分離膠與5%濃縮膠的組合，實(shí)現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker各條帶的清晰分離；電泳電壓與時(shí)間的優(yōu)化則有效避免了蛋白質(zhì)條帶拖尾、重疊現(xiàn)象，確保了分離效果的穩(wěn)定性。
與其他同類(lèi)垂直電泳儀相比，北京六一DYCZ-25E型P4垂直電泳儀具備顯著的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)：其一，采用雙垂直板凝膠槽設(shè)計(jì)，可同時(shí)進(jìn)行2塊凝膠的電泳實(shí)驗(yàn)，大幅提升了實(shí)驗(yàn)效率，適合批量樣品的檢測(cè)需求；其二，配備高精度穩(wěn)壓穩(wěn)流電源，電壓輸出誤差小，確保了電泳過(guò)程的穩(wěn)定性，連續(xù)多次實(shí)驗(yàn)的RSD僅為0.47%；其三，凝膠模具密封性能良好，可有效防止漏膠現(xiàn)象，且操作界面簡(jiǎn)潔直觀，便于新手快速掌握；其四，設(shè)備性價(jià)比高，維護(hù)成本低，更適合科研實(shí)驗(yàn)室、高校教學(xué)及中小型生物企業(yè)的日常使用。
在實(shí)際應(yīng)用中，需注意以下要點(diǎn)：一是凝膠制備過(guò)程中，APS和TEMED的加入量需準(zhǔn)確控制，且需快速混勻注入模具，避免凝膠聚合不均影響分離效果；二是電泳緩沖液需新鮮配制，且電泳過(guò)程中需確保緩沖液液面沒(méi)過(guò)凝膠，防止產(chǎn)生氣泡；三是樣品處理需充分，95℃水浴加熱時(shí)間需嚴(yán)格控制在5min，確保蛋白質(zhì)完全變性；四是電泳結(jié)束后，需及時(shí)進(jìn)行染色與脫色處理，避免蛋白質(zhì)條帶擴(kuò)散。此外，該方案可根據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)的分子量范圍調(diào)整凝膠濃度，進(jìn)一步拓展儀器的應(yīng)用范圍，如對(duì)于小分子蛋白質(zhì)（<20kDa）可選擇15%分離膠，對(duì)于大分子蛋白質(zhì)（>100kDa）可選擇8%分離膠。
5 結(jié)論
本研究建立的基于北京六一DYCZ-25E型P4垂直電泳儀的蛋白質(zhì)分離與純度鑒定方案，操作規(guī)范、高效可靠，通過(guò)SDS-PAGE技術(shù)可實(shí)現(xiàn)不同分子量蛋白質(zhì)的清晰分離，準(zhǔn)確完成蛋白質(zhì)分子量測(cè)定與純度鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該電泳儀分離效果好、分辨率高、穩(wěn)定性強(qiáng)，所建立的方案線性關(guān)系良好（R²=0.9992），樣品純度鑒定結(jié)果準(zhǔn)確，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤0.47%。該方案可有效滿足科研實(shí)驗(yàn)、高校教學(xué)及生物制品生產(chǎn)過(guò)程中蛋白質(zhì)分離與純度鑒定的需求，為相關(guān)領(lǐng)域的研究與生產(chǎn)提供了實(shí)用的技術(shù)支撐。北京六一DYCZ-25E型P4垂直電泳儀憑借其優(yōu)異的性能、便捷的操作及高性價(jià)比，在生物醫(yī)學(xué)研究及生物產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，可進(jìn)一步拓展至蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）的前期分離等應(yīng)用場(chǎng)景。
